Почему же пчелам столь опасна кристаллизация глюкозы в зимнюю пору?
Зимой пчелы далеко не так активны, как летом, когда они, используя лишь секреты своих желез, растворяют не только глюкозу, но и сухой сахарный песок. Пчела зимой, облизав прилипшую к кристаллам глюкозы фруктозу, сбрасывает кристаллы на дно улья. События в целом развиваются очень неблагоприятно для семьи. Усвояемой части меда становится ровно в 2 раза меньше, значит, надо минимум в 2 раза больше вскрыть медовых ячеек и иметь в 2 раза больше запасов корма. Эти условия далеко не всегда соответствуют положению в улье. Семья, кроме того, начинает беспокоиться, потребление корма еще более увеличивается, угрожая переполнением кишечника и болезнью, и круг, замыкаясь, может привести семью к гибели.
Такие кристаллизующиеся в сотах меды, несмотря на принятые пчелами «технологические меры», образуются из нектара определенных медоносов, которые пчеловод должен хорошо знать. К ним относятся: сурепка, дикая редька, рапс (то есть большинство крестоцветных), а также подсолнечник и некоторые другие, не столь важные медоносы. В нектаре всех этих растений повышенное содержание глюкозы, что благоприятствует последующему усвоению в кишечнике, но ставит пчелам «подножку» во время зимовки.
Интересно, что встречаются и противоположные случаи: в нектаре белой акации фруктозы в 2 раза больше, чем глюкозы (М. Баттальини и др., 1973). Мед с белой акации, даже слитый в бочки, может не кристаллизоваться по полгода и больше. Привезенный на продажу, он вводит в заблуждение работников ветеринарно-санитарной экспертизы колхозных рынков. Если несвоевременно закристаллизовавшийся мед опасен для пчел, и пчеловод его должен своевременно заменить на более качественный, то для человека такой мед никакой угрозы не представляет. Наоборот, незакристаллизовавшийся в срок мед вызывает опасение, что он не натуральный, а фальсифицированный. Вот тут белая акация и несколько других медоносов и путают в целом стройную картину.
Потребителю, чтобы приобрести действительно натуральный продукт, приходится быть начеку или полагаться на возрастающую опытность и вооруженность экспертного надзора.
Несмотря на все трудности, пчелы обычно удачно решают задачу создания максимально концентрированного продукта, который гарантирует им выживание в условиях длительной бескормицы. Однако защитная система меда от агрессивной микрофлоры далеко не ограничивается физическими факторами. Практический опыт использования меда в народной медицине, в мумификации, консервировании, наконец, прямые биологические тесты свидетельствуют не только о пассивной самообороне меда, но и об его выраженной антимикробной активности.
ЗАЩИТНЫЕ ВЕЩЕСТВА МЕДА
(Молекулярная охрана меда. — Фермент ингибин. — Химические «ухищрения» суллы.)
Мне пришлось участвовать в исследовании защитной системы меда во время служебной командировки в Рим в 1977 году. Работа проводилась в лаборатории фармацевтической химии Высшего института здравоохранения. Для таких исследований решено было взять образцы монофлерного (собранного практически с одного растения) меда, поскольку медоносные растения в любой стране очень сильно различаются по набору тех соединений, которые призваны играть защитную роль (см. далее главу о прополисе). И это вполне естественно, так как различия между видами – это в первую очередь различия в их защитных веществах, позволяющих каждому виду какое-то время существовать, прежде чем стать пищей другого.
Исследовать мед как таковой, то есть смесь, отобранную с улья путем центрифугирования, имеет смысл только с точки зрения определения его общих, например пищевых свойств, или выработки критериев стандартизации. Задавшись же целью изучить защитную систему меда в связи с его источником – нектаром, можно исследовать любой, но вполне конкретный вид меда.
По договоренности с профессором Карло Казинови – главой лаборатории, в которой велась работа, мы решили сосредоточить свое внимание на нектаре бобовых растений, поскольку еще в Москве я подробно изучал защитные вещества корневой системы клевера красного, важного медоносного и пыльценосного растения.
Итальянские коллеги заинтересовались вкусовыми качествами…
Монофлерный мед именно с этого растения достать не удалось, но благодаря помощи итальянских коллег в распоряжении лаборатории оказались нужные образцы с родственнных клеверу видов растений. Поступившие партии меда были значительные (по 20-22 кг), но итальянские химики, проявившие необычайный интерес к теме исследования, не в меньшей степени заинтересовались и вкусовыми качествами образцов. Лишь с большим трудом удалось сохранить для научного эксперимента примерно половину исходной партии.
Первая наша цель заключалась в выделении биологически активных веществ из водонерастворимой части меда, так как представление об антибактериальной системе, действующей в его водорастворимой части, уже сложилось ранее. Ее действие оказалось очень интересным и было связано с ферментом, который пчелы добавляют в нектар при изготовлении из него меда. Фермент, получивший название ингибин, осуществляет окисление одного из основных Сахаров меда – глюкозы – в глюкуроновую кислоту (схема 2) с выделением перекиси водорода. Это вещество – абсолютный яд для большинства микроорганизмов, что и объясняет микробную «чистоту» натурального пчелиного меда. Впрочем, пчелы добавляют этот фермент и в сахарный корм, если пчеловод предложит своим подопечным такую пищу. Полученный в результате так называемый сахарный мед, как мы объяснили выше, уже не будет содержать много исходного тростникового сахара, а вместо него – примерно равные количества фруктозы и глюкозы, что придаст ему несколько большую сладость. Фермент же ингибин обеспечит сахарному меду более надежное сохранение в условиях грядущей зимовки и в ранневесенний период. На этом и основано «золотое правило» пчеловодов: кормить пчел лишь в теплое время, когда их глоточные железы достаточно активны и способны «облагородить» вынужденно даваемый заменитель – сахар.
Схема 2. Антимикробное действие иигибиновой системы в пчелином меде
Работает эта живая, или, вернее сказать, молекулярная, охрана, удивительно «сообразуясь» со складывающимися условиями в улье. Собираясь в плотный клуб на зимовку, пчелы перестают поддерживать строгие параметры температуры и влажности во всех зонах улья, и рамки, находящиеся у края гнезда, где мед не полностью запечатан, могут оказаться в условиях повышенной влажности. Однако мед, впитывая влагу, противостоит размножению дрожжевых грибов «внутренними средствами»: при возрастании концентрации влаги в меде активность ингибиновой системы так же резко возрастает. Она начинает продуцировать гораздо большие количества перекиси водорода, которых бывает достаточно для того, чтобы сберечь мед до весеннего потепления. Тогда пчелы вновь «включат» свой кондиционер, и грибам придется отступить с занятых рубежей.
Немецкий исследователь И. Г. Дустманн (1978), детально изучавший фермент ингибин, нашел, что он крайне чувствителен к самым, казалось бы, незначительным отклонениям от обычных условий в улье; легко разрушается не только от солнечного, но и от электрического света, не терпит подогревания и т. д. Поэтому, если пчеловод хочет сохранить первозданную свежесть меда, он должен учитывать и эту повышенную требовательность столь грозной для грибов и микробов защитной системы.
Тем не менее выявление ингибина не ответило еще на многие вопросы.
Пчелы «нашли» универсальный ключ к упрочению защиты меда, включая и те случаи, когда он временно окажется в условиях повышенной влажности, а нет ли такой же системы у нектарников? Открытая железа растений – нектарник – также как-то должна быть защищена от посягательства микроорганизмов, тем более, что ее основная продукция – нектар – содержит углеводы, на которые особенно падки все представители невидимого мира.
Закономерно предположить, что нектар непременно имеет свою собственную систему защиты вне зависимости от последующей переработки его пчелами. Рассуждения можно построить следующим образом: растений-медоносов тысячи видов, причем вследствие свойственной видоспецифичности защитных средств у каждого из них свой набор биологически активных соединений. Все виды растений-медоносов прошли долгий путь встречной эволюции или, как еще говорят, сопряженной эволюции (коэволюции) к пищевым потребностям опыляющего их животного, например пчел, а их пищевые продукты еще ни одному человеку не принесли ущерба, разумеется, при условии умеренного потребления. У нашей же пищевой индустрии много забот о том, как изыскать эффективные, но безвредные для организма человека вещества, которые надежно оберегали бы свежесть фруктов, овощей, консервированных продуктов. В меде же, думали мы, такие вещества есть, сама природа, «потрудившись» миллионы лет, создала их.
Задача изыскания этих медово-нектарных консервантов очень заинтриговала и итальянских коллег, у которых проблем с хранением, особенно овощей и фруктов, в их теплом климате более чем достаточно.
Прямо исследовать защитные вещества нектара не представлялось возможным из-за технических проблем. Во-первых, он мало доступен, а, во-вторых, концентрация в нем нерастворимых в воде веществ, которые предполагалось изучать, столь мала, что набрать их в достаточном для исследования количестве просто невозможно.
Пришлось прибегнуть к помощи «патентованных специалистов» по сбору нектара – пчел – в надежде, что задачу облегчит работа только с монофлерными медами. Те соединения, которые проявляют биологическую активность, но отсутствуют в других типах меда, можно будет смело отнести к искомым защитным веществам данного вида растений.
Получив порцию монофлерного меда, собранного со сладкого клевера (Hedysarum), я приступил к химическим исследованиям. Мед пришлось разбавить в несколько раз водой, добавить в него кислоты и сделать, таким образом, совершенно непригодным для продолжающихся проявлений любознательности итальянских химиков. После этого можно было спокойно работать.
Предстояло исследовать активные вещества, содержащиеся, как говорят химики, в липофильной части меда, то есть те, которые удается убрать из водного окружения каким-либо органическим растворителем, например эфиром или этилацетатом.
Мой интерес именно к этой фракции был вызван следующими соображениями. Мед в основном представлен прекрасно растворимыми в воде веществами. Собственно нектарная капля и вбирает в себя лишь то, что растворимо в ее влаге. Однако если мед растворить водой и проэкстрагировать каким-либо органическим растворителем, часть веществ перейдет в отделившийся слой растворителя, другая же, большая, останется в воде.
Многие исследователи проводили биологическое тестирование разделенных таким образом частей раствора меда и нашли, что обе они обладают способностью сдерживать рост бактерий либо грибов. Поскольку уже выяснено, что водная фаза — поле деятельности ингибина, интересно было установить, какое вещество проявляет активность среди тех соединений, которые при случае могут покинуть водную среду.
В нашем опыте разбавленный и приведенный в пищевую непригодность мед был проэкстрагирован этилацетатом, который и вобрал в себя все интересующие нас молекулы. Экстракт путем различных химических приемов очистили, высушили сульфатом магния, после чего стали его упаривать, чтобы получить концентрированный остаток.
Вот здесь и произошло то редкое, но с волнением ожидаемое событие, которое так всегда радует химика: из сгущаемого раствора стали выпадать белоснежные кристаллы. Их оказалось необычно много. Всего этилацетатом проэкстрагировалось 12 г, а на долю этих кристаллов пришлось около 8 г, то есть более 75%. Еще значительную долю этого же вещества мы получили при дополнительных более сложных формах очистки маточного раствора, оставшегося после выпадения кристаллов (хроматографии на колонках и в тонком слое и т. д.).
После дополнительной перекристаллизации вещества и получения абсолютно чистых кристаллов предстояло сделать главное — установить химическое строение выделенного соединения. Эта работа не заняла много времени: вещество оказалось очень простым.
Достаточно было снять масс-спектр (Масс-спектр и спектр ядерно-магнитного резонанса — приемы физико-химического анализа веществ, при помощи которых устанавливают строение молекул), определяющий массу молекулы и некоторые другие ее характеристики, и спектр ядерно-магнитного резонанса, в котором уже по-разному проявляют себя атомы водорода, включенные в молекулы, чтобы мы могли уверенно сказать, что имеем дело с бензойной кислотой!
Немедленное прямое сравнение с образцом этого вещества, имеющегося в каждой химической лаборатории, показало, что ни приборы, ни мы не ошиблись: смешанная проба растертых порошков обоих веществ, выделенного нами из меда и взятого с химической полки, расплавилась при той же температуре, что и каждое вещество порознь, то есть при 121оС. Это и есть самый надежный, хотя и достаточно допотопный метод прямой идентификации веществ.
Таким образом, сомнения в подлинности бензойной кислоты отпали. Конечно, сначала мы были немного разочарованы тем, что идентифицировали хорошо знакомое вещество, а не совсем новое, чего так ждет каждый химик, работающий с природными соединениями.
Тем не менее наша цель была исследовать защитные вещества меда и нектара, а не искать новые, ранее не описанные соединения. Неожиданное обнаружение в столь больших количествах бензойной кислоты было в некотором отношении даже полезным: оно заставляло задуматься о роли давно и, казалось бы, хорошо изученных соединений.
Я решил вспомнить историю бензойной кислоты и те источники, где она была обнаружена химиками.
ИЗОБРЕТАТЕЛЬНОСТЬ ВИДОВ
(Секреты тропических смол. — Защитные силы зеленых яблок. — Человек уступает первенство. — «Силосные башни» в улье.)
Впервые эту кислоту получили на заре развития органической химии в начале XVII века из так называемого росного ладана, или бензойной смолы, которая и дала веществу свое название. В этой приятно пахнущей смоле на долю кислоты приходится примерно десятая часть, но она легко выделяется путем возгонки, так как обладает высокой летучестью пара. Росный ладан (бензойная смола) — до сих пор постоянный предмет импорта европейских стран, в том числе и СССР, из Юго-Восточной Азии. Там бензойную смолу получают, делая надсечки на деревьях рода стираксовых (Styrax benzoin), дикорастущих в том регионе.
В ответ на поранение дерево начинает выделять защитную смолу, точно так же, как наши сосны при получении от них живицы. Защитная смола обладает не только приятным запахом, из-за которого ей не могут найти равноценной замены в парфюмерной промышленности, но и выраженной антимикробной активностью, благодаря чему используется и в медицине.
В парфюмерии без нее не обойтись
Бензойная кислота — непременный компонент этой смолы, заслуживает, вне всякого сомнения, несмотря на простоту ее химического строения, серьезного внимания. Она встречается не только в бензойной смоле, но и в других издавна прославленных смолах и бальзамах, например гвоздичном масле, перуанском и толутанском бальзамах. Растения выделяют это соединение во всех тех случаях, когда возникает угроза их целостности.
Почти столь же неожиданно, как и мы, столкнулись с бензойной кислотой английские ученые Е. Браун и Т. Свинбурн, которые занимались исследованием другого важного явления — причин устойчивости созревающих яблок к патогенному грибу Nectria galligena. Этот гриб вызывает хорошо известное садоводам заболевание под названием черной пятнистости. В благоприятных условиях темные пигментные точки, где первоначально основывает свою колонию гриб, локализуются на поверхности и далее не развиваются. При менее благоприятных стечениях обстоятельств яблоко чернеет все больше, пока окончательно не утратит ценность для окружающих видов, кроме всеядных микробов.
Установив, что яблоко способно бороться, исследователи решили выяснить, каким путем оно это делает. Плод разрезали пополам и на всю незащищенную поверхность нанесли суспензию гриба-патогена, после чего стали ждать развития событий. Через 10 дней, сделав еще один половинный разрез, они осмотрели результат борьбы располовиненного, но не сломленного яблока и отразили его на схеме, которую мы воспроизводим.
В районе среза образовались две укрупненные зоны, в которых шло какое-то особенно значительное противоборство, но гифы гриба туда не проросли. Браун и Свинбурн проэкстрагировали содержимое этих зон (инокулят) и, действительно, обнаружили в них появление нового биологически активного вещества.
Схема 3. Состояние яблочной ткани спустя 10 дней после заражения патогенной расой гриба N. galligena: А — зона развития гиф гриба; В — некротическая стерильная зона; С — здоровая ткань
Интересно, что идентифицированное соединение полностью отсутствовало в неповрежденных тканях и, следовательно, было явным ответом растения на постигшее его бедствие. Этот факт давал основание занести его в ряд защитных веществ, получивших название фитоалексинов (от греческих слов: фито — растение и алекс — защита). Большинство известных к настоящему времени фитоалексинов — довольно-таки сложные органические соединения, строение которых меняется от вида к виду. Чтобы установить строение каждого такого вещества, приходится иногда затрачивать многие месяцы, а то и годы.
Когда же английские исследователи сняли физико-химические характеристики заинтересовавшего их соединения, то они также открыли, что имеют дело с… бензойной кислотой.
Надо отдать должное этим авторам: несмотря на явную химическую примитивность «ответа» растения, они не только не разочаровались открытым, но и подвергли выявленный факт дополнительному тщательному изучению. В частности, они нашли, что для этой кислоты характерна четко выраженная зависимость активности от реакции среды (рН). Лишь присутствуя в растворе в недиссоциированной форме (не в виде соли), кислота проявляет антимикробное (и антигрибное) действие. Бензойная кислота оказалась активной против яблочного патогена уже при разбавлении 5 частей на миллион, однако при одном «но» — при кислотности не ниже той, которая свойственна незрелым яблокам, то есть при рН 3,8. Достаточно среде стать чуть более щелочной, например до рН 4,5, как активность падает более чем в 25 раз!
Браун и Свинбурн измерили концентрацию бензойной кислоты в зоне противоборства патогену и нашли, что она равна 200 микрограммам на 1 миллилитр. Этого вполне достаточно для надежного ингибирования (подавления) роста и размножения гриба. «Успех» гриба, если яблоко находится в хорошем состоянии благодаря тому, что садовод внимательно ухаживает за растением, всегда частичный: он успевает отвоевать лишь часть плода, пока растение еще не перестроилось на выработку сдерживающего начала.
Маленькие черные точки на вздутых от сочной сладости боках зрелых яблок — следы его прежних битв и одоления грибной «агрессии».
Интересно, что, созрев и став менее кислым, яблоко вновь может серьезно пострадать от остановленного, но не уничтоженного врага. В этом случае активная роль уже переходит к другим соединениям, эффективно действующим и в менее «кислой» обстановке.
Таким образом, простейшая ароматическая кислота проявила себя надежным соединением не только в защите раненых стволов тропических растений, но и в самозащите недозрелых яблок.
Я воспользовался данными английских исследователей и вместе с помощниками решил оценить, сколь надежно медонос сулла охраняет свои владения от нежелательных посетителей из грибного мира.
Для экстракции взяли 12 кг меда, а свободной кислоты выделили 8,2 г. Значит, концентрация бензойной кислоты в исходном материале равна не менее 1000 микрограммов (!) на 1 миллилитр, что в несколько раз превышает минимально необходимую для проявления биологического эффекта.
Учитывая, что сам нектар раза в 2 более жидок, чем мед, можно высчитать, что и сулла вырабатывает достаточное количество кислоты для предотвращения инфекции.
Более жидкий, чем мед, нектар с первого взгляда кажется очень уязвимым, но это не так. Во-первых, концентрация сахара в нем не так уж мала — около 50%. Во-вторых, растение обильно снабжает нектар легколетучими эфирными маслами, многие компоненты которых обладают выраженной биологической активностью. Содержание этих веществ потом сильно уменьшится в улье. В-третьих, железистая ткань нектарников быстро всасывает недоиспользованный нектар обратно и, таким образом, лишает пищи микрофлору. И, наконец, в-четвертых, общая инфекционная обстановка над стерилизуемыми солнечными лучами и провеваемыми всеми ветрами цветущими медоносами достаточно благоприятна.
Нектар, принесенный в тесный улей с температурой воздуха внутри 35оС, оказывается в более сложном положении. Для его сохранения пчелы вынуждены принимать дополнительные меры, добавляя в процессе переработки нектара пероксидазный фермент ингибин и закрывая восковой крышечкой ячейку с медом. Так предотвращается окончательная потеря ценных испаряющихся компонентов.
Описываемая ситуация с бензойной кислотой оказалась неожиданно интересной и с других точек зрения. Человек, не подозревая об «опыте» суллы или «сражениях» зреющих яблок, не исследовав подробно защитные порядки росного ладана и других смол и бальзамов, независимо пришел к признанию надежной консервирующей и охранной силы бензойной кислоты и теперь широко ее использует в качестве консерванта, причем для охраны не только своей пищи, но и пищи своих четвероногих кормильцев, добавляя ее, например, в силос.
Правда, человек выявил все это лишь несколько десятков лет назад, явно уступив первенство другим видам живой природы.
В процессе исследований меда с суллы меня, как и всякого интересующегося практическим пчеловодством, беспокоило, не приводит ли повышенная концентрация в меде бензойной кислоты к какому-либо вреду для пчел: ведь в Италии сладкий клевер дает большие взятки. Опрос местных пчеловодов, однако, показал, что они не наблюдали каких-либо отрицательных явлений в жизни пчелиных семей ни в летний период, ни в зимний. Среди потребителей мед с суллы пользуется вполне солидной репутацией за свой нежный вкус и тонкий специфический аромат.
Следовательно, и сулла не нарушила негласный среди растений-медоносов закон: кормить своих опылителей (а заодно и человека) только гарантированно безвредной пищей. В итоге выходит, что бензойная кислота — полноценный консервант с любой точки зрения. И все-таки защитная система меда лишь поманила в путь: сулла подтвердила, что и она «заботится» об антибактериальной защите нектара, но вещества нового пока не дала, а ведь сулла — далеко не единственный медонос. И у каждого из них — схожие проблемы с охраной своей сладкой продукции, а следовательно, и свои вещества-помощники в противодействии невидимому микромиру. Выявить эти природные консерванты, над которыми столько миллионов лет трудились растения и пчелы, — очень своевременное и нужное для человека дело.
Отрицательная обратная связь
Пчелы — прекрасные «специалисты» по консервированию растительной продукции. Свой белковый корм — пыльцу — они складывают разноцветными слоями в ячейку, «заботясь» о разнообразии стола тех, кто будет угощаться позже, утрамбовывают ее и заливают сверху медом. Колонии грибов, проникших в ячейку вместе с пыльцевыми зернами, оказываются лишенными доступа воздуха, то есть попадают в анаэробные условия. Хоть микроскопические существа и не привыкли к ним, но упорно продолжают при помощи своих ферментов расщеплять молекулы глюкозы, добывая из них энергию. Ввиду недостатка кислорода процесс окислительного расщепления заканчивается образованием молочной кислоты (а не углекислого газа и воды). Этот продукт метаболизма не удаляется, как углекислый газ или пары воды, в окружающую среду, а накапливается в той же ячейке, где «вознамерились» размножаться и грибы. На этом их пчелы и «подлавливают»: достигнув определенной концентрации, кислота начинает угнетать рост уже самих грибов. Возникает так называемая отрицательная обратная связь — продукт жизнедеятельности организма подавляет развитие его самого. Этот процесс, например, мешает нам получать и особо крепкую медовую брагу: уже при 10—12% спирта в сбраживаемом сусле дрожжевые грибы угнетаются, их размножение прекращается, и они образуют споры.
Задачу противодействия грибам пчелы «решили» чисто экологическим путем: не стали специально добавлять в ячеи с пыльцой какие-то кислоты-консерванты, а заставили «поработать» грибы. «Вкусив сладенького», они успокаиваются до весны, пока пчела-кормилица, разрушив охранный медовый слой, не съест содержимое ячейки вместе с ее многочисленными обитателями. Грибы, образовавшие споры, от этого не пострадают, другие же подвергнутся «разборке» на отдельные фрагменты-молекулы под действием пищеварительных энзимов пчелы.
