ХИМИЧЕСКИЙ ПАСПОРТ МОЛЕКУЛ
(«Упрямый» прополис. — Отчего апельсин горький? — Грозные антибиотики и «увертливые» микробы.)
Испытав в полной мере все взлеты и падения на тернистом пути исследователя, мы идентифицировали в конечном счете все девять компонентов самого распространенного в нашей стране типа прополиса. Формулы этих веществ приведены ниже (схема 6), они помогут нам разобраться в дальнейшем повествовании. Трудно переоценить информацию, содержащуюся в формуле каждого вещества. Любое природное соединение — это сама спрессованная эволюция, великий знак Природы. У вещества есть настоящее — его функция, прошлое — его история, путь его биосинтеза, «хозяева» — организм-продуцент и его ферментные системы, с «поточных линий» которых сошли молекулы.
Схема 6. Структурные формулы соединений, идентифицированных в наиболее распространенном в СССР типе прополиса (1968): 1—2 — флаваноны; 3—4 — флавоны; 5—6 — флавонолы
Проследим за тем, что скажут о прополисе формулы наших девяти соединений. Уже при первом взгляде на них даже не знакомому с химией человеку видно, что большинство веществ имеет явно родственную природу. При более внимательном рассмотрении обнаружатся и различия: неодинаковое число и характер функциональных групп (—ОСН3 и —ОН), наличие или отсутствие двойной связи в среднем кольце молекулы. Эти небольшие, казалось бы, изменения сильно влияют на многие характеристики вещества, в частности на хроматографическую подвижность и цвет пятен.
Так, флаваноны (соединения 1—2) дают после опрыскивания пластинок концентрированной серной кислотой очень красивый ярко-оранжевый цвет; флавоны (3—4) и флавонолы (5—8) — желтый, переходящий со временем в коричневатый; особую окраску дает и девятое соединение — ароматический альдегид изованилин.
Выделенные соединения хорошо кристаллизовались и имели довольно высокие температуры плавления. Это было удобно для очистки веществ и их идентификации. Однако и настораживало, потому что нас очень интересовало и «настоящее» выделенных соединений — их функции. Высокая же температура плавления могла свидетельствовать об их низкой растворимости в водных растворах, что серьезно осложнило бы оценку их биологической активности.
К сожалению, наши опасения подтвердились: большинство соединений более или менее хорошо растворялось в органических растворителях (спирт, ацетон), но «не желало» переходить в водные растворы. Когда же мы их вынуждали к этому, добавляя к спиртовому раствору воду, они образовывали густые эмульсии. Работникам группы биологических испытаний, возглавляемой кандидатом биологических наук И. Д. Рябовой, пришлось немало потрудиться, чтобы получить воспроизводимые результаты. Они не вызвали энтузиазма: лишь некоторые вещества проявляли заметную антимикробную активность, например флавонол (7), против кислотоустойчивых бактерий и флавонон (1) — против патогенных грибов. Активность эта была в пределах 15—30 микрограммов на миллилитр.
Ранее я занимался синтезом высокоактивных антибиотиков ряда тетрациклина и заинтересовался прополисом не только как интересным природным объектом, но и как продуктом, к которому не вырабатывается устойчивость (резистентность) микроорганизмов. Это очень важно, так как применение в медицине антибиотиков показало, что сила их резко идет на убыль. Причина этого очень тревожного факта заключалась именно в резистентности.
Каким же механизмом или веществами владеют пчелы, что сумели избежать столь неприятного явления, сводящего на нет все усилия химиков и микробиологической промышленности? Каков принцип использования биологически активных антимикробных веществ в улье и есть ли они вообще в самом прополисе?
На последний вопрос как будто бы уже ответили опыты Уайта, Лави, В. П. Кивалкиной и других исследователей, доказавших безусловную антимикробную активность экстрактов прополиса. Более того, идентификация некоторых биологически активных соединений показала, что активность прополиса можно связать и с конкретными соединениями, но она была по сравнению с антибиотиками невысокого уровня.
И. Д. Рябова, также увлекшаяся идеей «рассекречивания» прополиса, была в явном замешательстве: исходный спиртовой экстракт прополиса заведомо активен, а выделить вещество активнее, чем сам экстракт, не удается.
Прополис «не хотел» указать более активное вещество, чем он сам, хотя из большинства растений, например зверобоя, можно выделить активное начало, более эффективное, чем экстракт всего растения, где это начало разбавлено балластными для данной активности веществами.
Та же ситуация характерна и для микроорганизмов: чтобы выделить тетрациклин, пенициллин, другой антибиотик, освобождаются от балластных веществ, образованных растущим мицелием.
Ничего подобного с прополисом пока не происходило, хотя воображение рисовало очень заманчивую картину: найти соединения, прошедшие длительное «горнило» эволюционной проверки в весьма жестких условиях стесненного пчелиного пространства и заведомо безвредные для человека, поскольку он в течение тысячелетий систематически «вкушал» различные «изделия» пчел. Поэтому, когда на наших пластинках вспыхнул, наконец, всеми цветами радуги целый спектр соединений, было естественно надеяться найти среди них и эти «чудо-вещества».
Это «чудо», однако, не состоялось.
Тут мы стали догадываться, почему Мишель Барбье, прозанимавшийся прополисом 6—7 лет, явно охладел к нему: похоже, ученый тоже ожидал большей антимикробной активности. Капиталистические же фирмы, надо полагать, требовали реальных веществ.
У нас, однако, никогда не угасала вера в «эволюционную мудрость» пчелы. «Улей-то — стерилен, в конце концов», — говорили мы себе, размышляя над выявленными фактами.
Впрочем, ничего обескураживающего еще не было. Самые активные вещества могли прятаться среди тех, которые мы еще не выделили: девять компонентов далеко не исчерпывали химических ресурсов пчелиного клея. Судя по пятнам на пластинках, их было еще десятка два-три, если не больше.
Однако при таком ходе рассуждений следовало признать, что эти главные по весовой доли вещества являются по сути бесполезными в защитной системе прополиса. Логика не допускала, что пчелы выбрали столь «разбавленный» по активности продукт. Пришлось вспомнить про синергизм. Так называется явление, когда отдельно взятое вещество само по себе малоактивно или неактивно вовсе, а в присутствии другого вдруг обнаруживает всплеск (резонанс) активности.
Это предположение несколько утешало, но формулы веществ, которые мы к тому времени твердо установили, не давали особенно больших надежд и на явления синергизма. Дело в том, что флавоноиды, к которым относилось большинство идентифицированных в прополисе веществ, — очень распространенный класс природных соединений. Они встречаются почти во всех растениях, и уже одно это неопровержимо доказывает растительное происхождение основной части прополиса: ни животные, включая насекомых, ни микроорганизмы не способны синтезировать флавоноидный скелет молекулы.
С другой стороны, флавоноиды — очень загадочные соединения. Несмотря на их многочисленность и распространенность, их функция в растениях до сих пор остается во многом неясной. Что же касается их действия на другие организмы, в частности антимикробной активности, то они, как правило, проявляют ее лишь в высоких концентрациях или не проявляют совсем.
Идентификация большого числа флавоноидных соединений в прополисе вызвала и ряд других вопросов. Все вещества оказались в виде так называемых агликонов, то есть соединений, не содержащих сахарных остатков. В самих же растениях эти вещества, как правило, присутствуют именно в связанной форме или в форме гликозидов, когда к свободным гидроксильным группам молекулы присоединен один или больше остатков сахара, чаще всего глюкозы.
Здесь можно вспомнить о горьком начале созревающих апельсинов — нарингине (схема 7). Он имеет при гидроксильной группе в положении 7 остаток глюкозы. От этой связи и зависит горький вкус плода, который исчезает при созревании (молекула разрушается, что приводит к освобождению агликона и глюкозы, а они уже не дают горького привкуса). Нарингин — пример обычной формы присутствия флавоноидов в растениях.
Схема 7. Гидролиз гликозида нарингина в тканях
Почему же эти вещества в прополисе, если они попали в него из растений, утратили свои гликозидные «хвосты»? На все эти вопросы ответа пока не было.
Тот факт, что флавоноиды оказались главными компонентами в наиболее распространенном в нашей стране типе прополиса, конечно, сильно поднимал их «авторитет» в наших глазах, но сравнение с антибиотиками было далеко не в пользу первых. Мы, однако, рассудили следующим образом: прополис, как уже стало очевидным, представляет собой очень сложную смесь соединений. Некоторые из них проявляют хотя и невысокую, но заведомую активность. При большой концентрации в прополисе этих соединений любой микроорганизм окажется в затруднительном положении. Почему?
Представим сначала себе какой-либо антибиотик, например «исполин» типа тетрациклина или стрептомицина. Если мы подействуем этим сверхактивным веществом на колонию микроорганизмов, скажем, состоящую из 10 миллиардов отдельных клеток, то, как показывает практика, все они не погибают — всегда остается какая-то часть. Допустим, всего 10 клеток, но с них-то все и начинается! Эти микробы уже несут в себе тетрациклиноустойчивый участок в генетическом коде, и бесполезно на остаток колонии действовать новыми дозами антибиотика: они все равно не добьют оставшихся. Более того, последние могут еще более преобразоваться и даже начать употреблять антибиотик как пищу. Вот на что, оказывается, способны микроорганизмы!
Микробы способны на все
Однако одолеть прополис микробам не удается: все попытки найти прополисоустойчивые штаммы, несмотря на многократные, тысячные пересевы любых типов микроорганизмов, оканчивались безрезультатно.
Выходит, что тетрациклин, стрептомицин и подобные им «светила» антибиотического мира смертельно опасны для отдельных микроорганизмов, но сама популяция, если она достаточно велика, после первых «шоков» выживает, а впоследствии может даже и «не замечать» присутствия грозного врага.
Как свидетельствует сохраняющаяся уже миллионы лет стерильность улья и безуспешность пересевов с целью получения устойчивых штаммов, прополис не дает невидимым вредителям таких шансов.
Чем же берет микробов прополис? А вернее, что не позволяет им «взять» прополис?
Испытанный нами уже на первых этапах работы флавонол (схема 6, 7) проявлял антимикробную активность против некоторых штаммов при концентрации 25—30 микрограммов в 1 миллилитре. Выделенный Барбье и Лави другой флавонол — галангин — имел подобный уровень активности. По сравнению с тетрациклином это в сотни раз меньше.
Однако тетрациклин один, а соединений типа галантина в прополисе несколько. Это уже в 1964 году доказали опыты Барбье — Лави, которые, помимо галантна, выявили и еще одно антибактериальное вещество, впоследствии оказавшееся пиноцембрином. Эти вещества и многие другие, еще не идентифицированные, обладая различным химическим строением и, следовательно, неодинаковым механизмом антимикробного действия, совместно могли действовать намного успешнее «героя-одиночки» тетрациклина.
Действительно, вероятность того, что колония микроорганизмов выработает механизм устойчивости одновременно к нескольким соединениям, намного ниже, чем к одному, даже самому активному соединению.
Это, очевидно, и объясняет тайну устойчивости прополиса, словно бы «ощетинившегося» десятками различных соединений против любых типов микробов, посягающих на целостность провианта в улье и целебную чистоту его воздушной среды. Пчелам в конечном счете важнее надежность обороны, чем «личные» рекорды активности отдельных соединений.
Такой вывод устроил нас на первых порах, и мы сосредоточили свое внимание на главном вопросе: откуда же в ульях берется этот загадочный чудо-продукт?.
МОЛЕКУЛЫ СВИДЕТЕЛЬСТВУЮТ
(Круг сужается. — «Алиби» для пыльцы.— Подозревается тополь. — Кризис метода.)
Идентифицировав девять различных соединений в наиболее распространенном в нашей стране типе прополиса, мы далеко не закончили химическую работу. В нашем распоряжении находилось еще несколько кристаллических и маслообразных веществ и их смесей, строение которых предстояло выяснить.
Прежде чем двигаться дальше, необходимо было подтвердить, что наши результаты воспроизводимы, то есть что эти характеристические соединения достоверно встречаются в образцах пчелиного клея, полученного из различных по географическому положению районов страны. Одни лишь данные тонкослойной хроматографии имели только качественный характер, и их необходимо было проконтролировать выделением чистых индивидуальных соединений.
Много месяцев ушло на обработку еще нескольких образцов, в том числе одного случайно сохранившегося с тех времен, когда я только начинал свои пчеловодческие опыты в Тамбовской области. Моршанскую селекционную станцию, с пасеки которой был взят прополисный «оброк», окружала типичная для средней полосы России лесостепная флора, включающая как лиственные, так и хвойные леса, многочисленную кустарниковую растительность и пойменные травы чрезвычайно богатого состава. Однако и этот зеленоватый по виду прополис при тщательном разделении на колонках дал нам те же девять ранее выделенных соединений, причем примерно в таких же количественных соотношениях. Последнее обстоятельство было очень важным для дальнейшего поиска источника прополиса.
При изучении тамбовского образца обнаружилось, однако, и небольшое отличие: были выявлены два соединения (рамноцитрин и пиностробин), которые не встречались нам ранее.
Эти два вещества также флавоноидной природы содержались в очень малом количестве, что наталкивало на мысль о каком-то еще источнике прополиса, хотя и второстепенном по значению.
Однако говорить о другом источнике было явно преждевременно, поскольку происхождение источника основной «глобальной» группы веществ (соединений 1—9) оставалось не выясненным.
В принципе их «упорное» присутствие почти во всех образцах не противоречило гипотезе Кюстенмахера, скорее наоборот, и мы склонялись ее рассмотреть самым внимательным образом. Действительно, выделенные нами, впрочем так же, как Жобером и Барбье, соединения оказались лишенными гликозидных остатков, то есть были представлены собственно молекулой флавоноида или, как говорят в таких случаях, агликона. Более того, агликоны имели большее число метилированных гидроксильных групп. Если внимательно присмотреться к формулам веществ, выделенных из прополиса, можно увидеть, что все функциональные группы представлены либо свободным гидроксилом (ОН), либо метоксилом (ОСН3). Эти метоксильные группы встречаются в каждой молекуле, а некоторые из них (например, соединения 2, 4, 6, 7) имеют их по две.
Схема 8. Структурные формулы компонентов образца прополиса с Моршанской селекционной станции (1967)
Все это, казалось, соответствует высказанной немецким ученым гипотезе. Сравнительно небольшое число обнаруживаемых на нашей территории типов прополиса легко объяснить тем, что по своим природно-климатическим условиям страна разделена лишь на несколько резко отличающихся друг от друга ареалов, в частности на степной и лесостепной (лесной). Внутри каждого такого ареала состав фитоценозов, то есть растительных комплексов, более или менее стабилизирован, вследствие чего и пыльца (предполагаемый источник прополиса, вносимый в улей пчелами) должна иметь также более или менее стабилизированный по видам химический спектр соединений. Дальнейшая ее переработка пчелами могла еще более унифицировать состав всегда присутствующих в пыльце флавоноидных молекул. При этом допустимы два процесса: отщепление сахарных остатков от гликозидов флавоноидов, в виде которых они обычно присутствуют в пыльце, и дополнительное метилирование гидроксильных групп, освободившихся от связи с углеводами.
Действительно, все идентифицированные нами на первом этапе работы вещества (не считая ароматического альдегида — изованилина) объединяются лишь в четыре родственные по характеру замещения группы.
В наиболее широко представленной группе соединений (схема 6, 5—7), к скелету молекулы, образованному тремя ароматизированными кольцами, присоединены четыре различных заместителя, но в одних и тех же местах, которые, согласно общепринятой номенклатуре, нумеруются по соответствующим углеродным атомам (в данном случае 4′, 3, 5 и 7). В двух других группах (соединения 1—2 и 3—4) заместители находятся у того же углеродного скелета в положениях 4′, 5 и 7; у соединения 8 при пяти атомах углерода (4′, 3′, 3, 5 и 7). У соединений 1 и 2 основной скелет молекулы несколько отличен от остальных. В кольце С связь между атомами 2 и 3 стала насыщенной (ординарной) в отличие от двойной у соединений 3—8. Иными словами, каждый углеродный атом окружен максимальным количеством других, его валентности полностью насыщены. Эта разница, как уже сказано выше, существенно меняет свойства молекул, которые обретают иное родовое название — флаваноны.
Флаваноны близкородственны более многочисленным в прополисе флавонам, что хорошо видно по приведенным на схеме 6 структурным формулам.
Интересно, что если деметилировать (то есть удалить метальные остатки) описываемые вещества, то все восемь флавоноидных соединений превратятся лишь в четыре. Последние также существуют в природе и названы соответственно нарингенин, апигенин, кемпферол и кверцетин (схема 9).
Схема 9. Первый способ унифицирования флавоноидных агликонов прополиса
Исследуемую группу можно упростить и другим способом: подвергнуть всю смесь исчерпывающему метилированию, например действием йодистого метила (CH3J) в присутствии щелочи (схема 10). В таком случае свободные гидроксильпые группы всех соединений превратятся в метоксильные, и вновь мы получим всего четыре соединения — эфиры (10—13).
Схема 10. Второй способ унификации флавоноидных агликонов прополиса
Все излагаемые здесь сведения имеют прямое отношение к тем методам, которыми были установлены источники прополиса.
Первоначально, как уже было сказано, считалось, что компоненты прополиса образуются из пыльцы растений, переработанной пчелиной семьей. Не исключено, что они представляют собой устойчивую по составу смесь соединений, полученную следующим образом: на первом этапе все флавоноидные молекулы, содержащиеся в принесенной в ульи пыльце, при ее переваривании расщепляются энзимами пчелы до свободных агликонов и Сахаров. Затем сахара усваиваются, а свободные агликоны, представленные соединениями типа нарингенина — кверцетина, подвергаются избирательному метилированию специальными ферментами пчелы в соединения, которые мы и обнаруживаем в прополисе.
И гидролитическое ферментативное расщепление флавоноидных гликозидов и метилирование фенольных гидроксильных групп ферментами — переносчиками метальных групп в организме насекомого происходят постоянно. Следовательно, такой путь образования характеристических компонентов прополиса теоретически возможен. Чтобы проверить его экспериментально, мы поступили следующим образом. Собрали на пасеке при помощи пыльцеуловителя пыльцу, которую ежедневно вносят пчелы, тщательно проэкстрагировали ее спиртом, экстракт упарили в вакууме, после чего подвергли кислотному гидролизу в растворе так называемой смеси Килианц. состоящей из соляной и уксусной кислот и воды в соотношении 10:35:55. Достаточно прокипятить эту смесь, чтобы расщепить гликозиды и высвободить свободные агликоны, то есть осуществить процесс типа первого способа унификации флавоноидных агликонов прополиса (схема 9).
Проведение этой стадии было необходимо потому, что в собираемой пчелами пыльце флавоноиды могли находиться в виде самых различных гликозидов, число которых даже при наличии только 2—3 агликонов в смеси может быть огромным из-за различных способов привязки молекул друг к другу.
Проведя кислый гидролиз проэкстрагированных компонентов усредненного образца пыльцы, мы затем вновь извлекли органическим растворителем образовавшиеся продукты реакции и, не разделяя их, подвергли второй реакции — исчерпывающему метилированию. Она основана на действии йодистого метила в присутствии щелочного агента — гидрида натрия (ее унифицирующие свойства представлены на схеме 10). Из того же улья, которому принадлежала пыльца, взяли прополис и подвергли его реакции исчерпывающего метилирования в точно таких же условиях, как и пыльцу.
Теперь наступил решающий момент: сравнение данных хроматограмм. Картина была однозначной: никакого даже отдаленного соответствия не наблюдалось между красочной палитрой хроматограммы прополиса и бледными желтоватыми и серыми пятнами хроматографической полосы продукта метилирования экстракта пыльцы.
Опыты, как и полагается, были многократно повторены. Причем за ульями, предназначенными для опыта, тщательно ухаживали. Удалили весь ранее накопленный прополис, а само гнездо пчел вместе с рамками пересадили в новые, не содержащие следов старого прополиса ульи. За каждый 10-дневный период отбирали усредненную пробу пыльцы и накопленный за это же время прополис. Подвергая оба продукта описанным выше процедурам, мы так ни разу и не нашли соответствия, подтверждающего гипотезу Кюстенмахера.
Таким образом, отрицательный результат эксперимента показал несостоятельность предположений о происхождении прополиса из пыльцевых зерен. Этот вывод, конечно, резко сократил число «претендентов» на «трон» растений-прополисоносителей, но оставил его по-прежнему незанятым.
Не с тополиных ли почек прополис?
Пьер Лави и его коллеги о происхождении прополиса имели значительно более определенное мнение: они просто привели список растений, с которых пчелы якобы могут собирать этот продукт. Список был составлен на основании литературных данных и в него входили: ивы, тополя, вяз, растения рода стираксовых, каштан и многие другие. Очень длинный список только увеличивал неопределенность. Правда, Лави, Барбье и их сотрудники указали в качестве основного растения тополь, а точнее его почки.
Тополя растут и в нашей зоне. Мы без труда добыли нужное количество клейких и душистых, завернутых в коричневатые обложки почек, но, поставив хроматограммы с их экстрактом, быстро разочаровались: обнаруженные на пластинках пятна соединений никоим образом не соответствовали тем, что мы нашли в главном для нашей страны типе пчелиного клея.
Стало ясно, что французские исследователи имели дело с другим образцом прополиса, о чем явно свидетельствовали и результаты наших химических изысканий: ни галангина, ни хризина, ни остальных веществ, о содержании которых в прополисе французского типа уже в 1970 году сообщила группа Барбье, в нашем образце не было.
«Тем лучше, — подумали мы, — каждый делает свое дело и не создает далеко не всегда полезную конкуренцию, неизбежную при работе с одним и тем же объектом. Можно рассчитывать на взаимное методическое и идейное обогащение при таком распределении интересов».
Действительно, наши дальнейшие отношения с французскими коллегами приняли самый дружественный характер, следствием чего явились и совместные планы исследований одних и тех же образцов основного защитного вещества пчел.
Группа Барбье, к 1970 году выделив из прополиса пять соединений, все-таки сворачивала работу. К этому времени другой французский ученый Тронше нашел три тех же вещества, что и Барбье, в почках тополя черного (Populus nigra), что уже служило веским экспериментальным доказательством «тополиного» происхождения исследованного ими образца прополиса.
Однако я забегаю несколько вперед. В разгаре наших поисков источника основного типа прополиса мы отвергали методом прямого сравнения на пластинках с силикагелем источник за источником: почки всех хвойных растений — ели, сосны, лиственницы, их смолы с ранений и подсечек, выделения из трещин плодовых деревьев — слив, яблонь, смолистые выделения на подсолнечнике, смолке и множестве других подобных растений, о которых где-либо упоминалось или сообщали пчеловоды как о возможных источниках пчелиного клея.
Наконец, я сдался и решил, что таким чисто эмпирическим путем не разобраться в пчелиных тайнах.
Перестав исследовать леса и все то, что окружает пасеки, я предполагал углубиться в формулы выделенных нами соединений и определить, что же представляют собой флавоноиды с точки зрения их происхождения. Сейчас ответить значительно легче, но тогда многие со временем ставшие привычными понятия лишь формировались и далеко не в такой степени были самоочевидными.
