РАСТЕНИЯ-ДОНОРЫ
СЛОВО ЗА ХИМИЧЕСКОЙ ТАКСОНОМИЕЙ
(Песнь о вторичных метаболитах. — Коллектив или одиночка? — Новая наука об определении вида.)
Флавоноиды представляют собой типичные вещества вторичного обмена, или вторичные метаболиты, растений. Эта важнейшая группа соединений природного происхождения получила свое название в отличие от веществ первичного обмена, которые встречаются во всех клетках живой материи и абсолютно необходимы для элементарной жизни. К таким абсолютно необходимым веществам относят белки, нуклеиновые кислоты, углеводы, жиры.
Растеня-доноры
Но элементарная жизнь, хотя и составляет основание всякой жизни, еще не дает всего разнообразия присущих ей форм. Вот это-то разнообразие жизни, то есть существование неисчислимого множества видов, если его рассматривать на химическом уровне, и связано с веществами вторичного обмена. Именно они отличают один вид от другого.
В процессе эволюции каждый организм созидал все новые специфические вещества или их комплексы, которые помогали ему как можно лучше приспособиться к условиям среды.
Впервые великое значение вторичного обмена отметил, сам того не зная, основоположник учения о наследственности Грегор Мендель. Окраска цветов гороха, которая послужила выявлению фундаментальных законов наследственности, обусловлена антоцианами, вторичными метаболитами, родственными тем, которые находятся в прополисе. К сожалению, во времена Менделя хроматография еще не была открыта, и он в своих наблюдениях опирался скорее на зоркий глаз и интуицию, чем на количественные данные о присутствии конкретных соединений в лепестках очередного гибрида. Сейчас подобные данные доступны каждому современному ученому.
Вторичные метаболиты — это химические соединения, обусловливающие окраску цветочных лепестков, аромат растений, их горький или приторно-сладкий вкус; вторичные метаболиты — это не воспринимаемые человеческими органами чувств пахучие вещества, которыми обмениваются насекомые во время брачных полетов, а муравьи и пчелы метят свои трассы; вторичные метаболиты — это, в конечном счете, и защита вида, и его «крик» о помощи, и его химическое лицо, и химический язык. Все многообразие, сбалансированность и целостность нашего мира определяются в большой степени функциями вторичных веществ. И гормоны, и лекарства, и природные регуляторы роста растений — все это из нескончаемого списка «дел» вторичных метаболитов растений и животных, углубленное систематическое изучение которых, их «золотой век», вероятно, только начинается.
Работы здесь действительно непочатый край. С этим и столкнулся автор со своими помощниками, как только пришел к мысли химическим путем решить проблему растительного источника прополиса.
Прежде всего мы приступили к изучению привлекшей наше внимание закономерности: во всех образцах типичного прополиса соотношение основных характеристических соединений, невзирая на район, из которого доставлен образец, одно и то же. На первый взгляд, наиболее естественно было предположить, что эту смесь веществ продуцирует одно растение. Однако дальнейшее размышление поколебало нашу уверенность. Растения обычно заселяют любой участок суши совместно с другими видами, в итоге чего формируется растительный комплекс, или фитоценоз. Как и любая сложная система с обратными связями, фитоценоз обретает выраженные черты стабильности и проявляется, например, в типичном сочетании видов в наших лесах. Березе обычно сопутствуют осина и ольха, дубу — липа и орешник, иве — тополь и т. д. Тонкие знатоки местных фитоценозов — грибники и охотники — по неуловимым, казалось бы, приметам, а на самом деле — по таким видовым сцепкам определяют экологическую нишу, которую непременно заселит либо нужный гриб, либо зверье — заяц, лисица…
Грибники-охотники определяют экологическую нишу
Законы фитоценоза наталкивали на мысль, что устойчивая по составу смесь веществ в прополисе могла образоваться и вследствие сбора пчелами клейких веществ одновременно с двух-трех или большего числа совместно произрастающих в одном фитоценозе видов растений. Если это действительно так, то поиск наших совмещенных видов «наугад», как мы поначалу делали, собирая в пенициллиновые баночки любые смолистые подтеки и капли, был заранее обречен на неудачу.
После этого мы окончательно осознали, что без химической таксономии мы «далеко не уедем». Химическая таксономия — это наука об определении видов по химическим признакам, обусловленным специфичностью обмена веществ. Но не все специфические вещества, синтезируемые каким-либо организмом, подходят для химической таксономии. Если такое вещество появляется в растении лишь на короткое время и в очень малых количествах, оно мало пригодно для химической оценки вида.
Наиболее удобны для заполнения такой «визитной карточки» вида те соединения, которые встречаются в зонах пониженной активности обмена веществ растения, например в древесине.
Исследования древесины хвойных химическими методами дали блестящие результаты и способствовали развитию новой науки. Успех был обеспечен тем, что в древесине хвойных широко представлена группа фенольных веществ типа халконов (вещества типа 10, схема 10), а также уже известных нам флаванонов и флавонов. Эти вещества, содержащиеся в древесине, практически не подвергаются изменениям, связанным с колебаниями суточной либо сезонной метаболической активности, что делает их идеальными для определения видовой принадлежности.
Иногда бывает необходимым опознать всего 2—3 вещества, чтобы достаточно надежно, не видя ни формы листа, ни ажурного рисунка его прожилок, не зная ни одного морфологического признака, определить вид и семейство растения, от которого исследователю попал тем или иным способом небольшой кусочек древесины или его экстракт.
О такой химической таксономии Грегор Мендель не мог и мечтать. Ему приходилось рассчитывать на свою обостренную наблюдательность и работать лишь с интегральной (совокупной, объединенной) характеристикой этих веществ, то есть с цветом.
Наше положение было несравненно лучше, поскольку в распоряжении находилось девять идентифицированных и явно наиболее удобных для химической таксономии веществ.
Просмотр новейших химических справочников и реферативных журналов показал, что еще не было описано ни одного растения, которое одновременно могло бы синтезировать все девять выделенных нами соединений. Значит, если такое растение существует, то просто у химиков «руки еще не дошли» до него (химическая таксономия только родилась, и ее методами обследована небольшая доля представителей богатейшей флоры). Не исключалась и другая возможность: в созидании прополисной смеси приняло участие сразу несколько растений, поэтому следовало ловить любой «знак», любое сообщение о присутствии хотя бы одного из веществ в каком-либо виде.
И мы начали с самых простейших соединений. Флавон акацетин (схема 6, соединение 5), судя по его «автобиографии», слишком широко распространен: его находят в северных и южных растениях, лепестках цветов, листьях, древесине, корнях, пыльце и других частях огромного количества видов. Ясно, что акацетин не выведет нас на «правильную дорогу».
Ближайший аналог акацетина флаванон (2) был к тому времени известен лишь как синтетический образец, то есть полученный путем химического синтеза, а в природных источниках не встречался.
Одно из соединений группы кемпферола — флавонол (7), недавно открытое природное вещество, не мог «сообщить» нам какой-либо информации об источнике. Другое соединение этой группы — флавонол (б), у которого метоксильные группы расположены при углеродных атомах 4′ и 7, был практически одновременно с нами найден в одном растении, произрастающем только в Австралии. Естественно, что наши пчелы не могли использовать этот источник для сбора прополиса. Кроме того, он был обнаружен не среди смолистых выделений, а в экстрактах листьев, что также исключало возможность его использования как источника пчелиного клея.
Остальные два представителя соединений этой группы — флавонолы кемпферид (5) и рамноцитрин, выделенный из тамбовского образца, были, как и акацетин, очень широко распространенными веществами, поэтому и не несли нужной нам информационной нагрузки.
СЛЕДЫ ВЕДУТ К БЕРЕЗЕ
(Подсказка флавона. — Метаморфозы деревьев — продуцентов смол. — Выручает деревня Комаровка.)
Ситуация складывалась прямо-таки обескураживающая: выделена масса соединений, на которые потрачено столько труда, казалось бы, гарантированно обеспечен ответ, но вот, как говорят болельщики, «мимо»…
И все же нам повезло: одно вещество (приведем его полное химическое название за «заслуги» перед прополисом) — 4′, 7-диметокси-5-оксифлавон (схема 6, 4) оказалось еще в 1933 году описано немецкими учеными Бауером и Дитрихом как компонент масла почек белой березы (Betula alba).
То, что белая береза — один из синонимов нашей обычной березы повислой, или бородавчатой, мы узнали позднее, а поначалу, прочитав это сообщение, тут же вспомнили, что и береза числилась в списках возможных прополисоносителей. С какой же части растения пчелы берут прополис, понять было трудно. Листья ее отнюдь не клейкие, а летние почки еле видны глазом. Более того, и Кюстенмахер, и другие исследователи, пытавшиеся узнать, где пчелы летом могут брать смолу, когда почки уже давно превратились в роскошные зеленые листы, даже и не рассматривали теоретически такую возможность.
Помнится, что мы тщательно исследовали трещины на коре этого дерева, надеясь встретить там смолистые подтеки, столь обильные у хвойных, но ни подтеков, ни выделений не оказалось.
Тем не менее химическая таксономия указала район поиска, и я, не долго мешкая (дело было в феврале), спустился из своей лаборатории вниз, где прямо у входа в институт росли молодые березки. Десяток собранных почек залил небольшим количеством спирта, тут же приготовил пластинку для хроматографии и нанес на нее две капли полученного экстракта и такое же количество аналогичного экстракта прополиса. Все присутствующие в лаборатории чуда не ждали, тем большим было изумление, когда после проявления пластинок и опрыскивания их концентрированной серной кислотой на рядом расположенных хроматографических полосах, по которым вслед за фронтом растворителей «бежали» компоненты исследуемых смесей, вспыхнули всеми цветами радуги совершенно одинаковые пятна, очевидно, идентичных соединений!
Все решилось в один миг. Над загадочным образцом прополиса, таким образом, «трудилось» не несколько растений, а лишь одно, и этим растением, вне сомнения, была береза — наше самое распространенное растение.
Однако предстояло еще немало работы, чтобы окончательно разобраться в том, какие березы продуцируют необходимую пчелам смесь соединений.
Итак, я собрал для своего анализа зимние почки березы, зимой же, как известно, пчелы заняты отнюдь не сбором прополиса, а летом все эти почки превращаются в листья. Где же в таком случае будет источник клея?
Сотрудники лаборатории продолжали время от времени общипывать почки со спящих берез и ставить хроматограммы. Когда миновал март и уже по-весеннему припекло солнце, при очередном отборе проб с последующим хроматографическим анализом вдруг произошло невероятное: почки, которые всю зиму строго «держали» состав, эквивалентный прополису, вдруг словно бы ожили и то, что мы проэкстрагировали с их покровов, уже никак не напоминало ни их предыдущий состав, ни состав прополиса!
Удивлению нашему не было предела, причем этот факт привлек к себе самое серьезное внимание и как проявление более общей биологической закономерности. Столь резкое изменение в содержании большой группы веществ вторичного обмена, соответствующее фазе весеннего пробуждения, побуждало к исследованию химической природы покоя и пробуждения растений, что прямо связано с «ахиллесовой пятой» многих культур — зимостойкостью.
Подобные работы и были проведены впоследствии, здесь же я продолжу рассказ о «химическом поведении» березы.
Еще во многом таинственный обмен веществ, протекающий в почках, явно изготовившихся стать листьями, еще раз удивил нас своим «возвращением к прошлому». Незадолго до начала пыления березовых сережек, то есть перед самым раскрытием листьев, уже чуть-чуть надтреснувшие и набухшие почки вдруг стали маслянисто-липкими, а экстракт с них, полученный обычным образом, оказался по составу своих главных компонентов вновь идентичным тому, что был зимой, а заодно и прополису исследуемого нами типа.
Через день-два картина изменилась, и почка, как во время весеннего пробуждения, вновь стала синтезировать вещества, отсутствующие в ней в зимнее время. В целом изменения в почках, происшедшие в весеннее время до момента цветения (перед началом пыления сережек), сводились к исчезновению характерной группы веществ. Общее количество вещества, экстрагируемое спиртом, также резко уменьшилось, видимо, дерево освобождалось от каких-то соединений, не нужных ему в период активного роста. Не исключено, что это были ингибиторы, полезные для поддержания зимнего покоя, но уже вредные растению, когда ему нужно ловить лучи солнца и растить новые ветви.
О том, что в экстракте зимующих почек содержится много ингибиторов, свидетельствовали и данные, полученные французским исследователем Гонэ, который нашел, что прополис всегда содержит очень активные ингибиторы роста. Зимний же состав почек был идентичен составу прополиса, что достаточно определенно указывало на содержание в них этой важнейшей группы природных регуляторов.
Появление же вновь комплекса ингибиторов незадолго перед цветением соответствовало и известным физиологическим фактам: именно в это время в растении ненадолго прекращаются ростовые процессы, чтобы продлиться после фазы отцветания. Такую картину мы и наблюдали на березах, расположенных вдоль улицы Ляпунова в Москве, где находится одно из зданий института, в котором велись описываемые исследования. Однако необходима была большая осторожность в окончательных выводах.
Мы подождали 3—4 недели после того, как почки развернутся в лист, за это время в пазухах листьев развились их запасные органы — пазушные почки, небольшие зеленоватые образования, так долго ускользавшие от внимания пчеловодов, что они даже просмотрели березу как важнейший источник прополиса.
На этих почках, как мы их внимательно ни разглядывали, так и не могли увидеть ничего клейкого и смолообразного, что могли бы собрать ловкие жвалы пчел или любого другого насекомого. Экстракты этих почек тоже не давали нам ничего утешительного: они вовсе не походили на ту радостную для нашего глаза картину, созерцая которую мы уже решили, что основной источник прополиса нами опознан раз и навсегда.
На своей пасеке, расположенной недалеко от Москвы близ станции Сходня, где росло предостаточно берез, я соскабливал с рамок прополис и привозил в лабораторию. Его хроматографический анализ неизменно давал одну и ту же картину, идентичную экстракту зимних почек березы.
Наконец, казалось мне, настал долгожданный день! В июне по-летнему пригрело солнце, и березы заблагоухали каким-то особым ароматом. При ближайшем рассмотрении одной из ветвей я увидел долгожданное: сквозь верхний кончик уже немножко к этому времени «потолстевших» почек выкатилась капелька на вид очень светлой жидкости. Я прикоснулся к ней пальцем и осторожно отвел в сторону. Между пальцем и почкой повисла еле заметная нить.
Следовательно, пазушная почка, несмотря на свою малость, способна ради какой-то пока еще не понятной цели выделять такую массу (по сравнению с ее размерами) липкого материала, что его, без сомнения, может собрать не только пчела, но и человек, вооруженный, например, скальпелем. Я так и сделал и, набрав несколько микрокапель, вновь поставил хроматограмму. Результат ее не утешил: на пластинке отчетливо виднелись желтые пятна ряда соединений, заведомо присутствующих в прополисе, в том числе и флавона (схема 6, 4), который в свое время «подсказал» нам заняться березой, но особенно характерные соединения, дававшие на пластинках огненно-красные пятна, отсутствовали в экстракте пазушных почек.
Пришлось вновь обратиться к ульям. Еще раз освободил их от всякого ранее собранного прополиса и стал наблюдать за качеством свежего пчелиного клея по данным хроматографических анализов. Установившиеся теплые дни лета способствовали выделению растениями смол, и пчелы, лишившись необходимого им материала, спешно компенсировали недостачу. Анализ этого «новенького» прополиса совсем запутал нас: он был абсолютно схож с тем, который в свое время мимолетно подарили нам спящие зимним сном почки февральской березы.
Мы вновь обратились к ульям
Если рассуждать теоретически, никаких сомнений не должно было быть: совпадение состава прополиса с составом почек хотя бы в одной фазе достаточно точно указывало на то, что продуцентом прополиса является береза. Но какая и какие ее почки? И то и другое не имело однозначного ответа. Видов берез в том же Подмосковье несколько, да и летних почек минимум два типа — вегетативные, пазушные, из которых развиваются листья, и апикальные, которые венчают кончик растущей ветви — апекс. Они также у березы липкие. Возможно, они-то и продуцируют нужную нам смесь веществ, но и это предположение не подтвердилось: в целом, они обнаруживали примерно ту же гамму соединений, что и рядом находящиеся пазушные.
Бывали случаи, которые окончательно запутывали нить рассуждений. В некоторые особенно жаркие дни пазушные почки вдруг резко меняли состав выделяемой смеси, и он оказывался в точности равным тому, что мы искали! Через некоторое время они вновь уже продуцировали старую более привычную для себя смесь, а пчелы продолжали приносить в ульи ноши прополиса, в котором была зимняя гамма пятен.
Тогда я перенес свои полевые эксперименты в лесостепную часть Рязанской области. В деревне Комаровка Захаровского района разместил несколько своих ульев. Вокруг была преимущественно остепненная местность, которую практически радиально иссекали искусственные лесные полосы из березы. Тополя в деревне и ее окрестностях вроде бы не росли. Расспросы местных пчеловодов и осмотр их пасек показали, что семьи пчел, несмотря на небогатство лесной флоры, не испытывают недостатка в прополисе.
Привезенные семьи стали весьма успешно накапливать клей. Состав его, вне сомнения, был березовым, и тогда я провел решающий эксперимент: как и в предыдущих случаях, очистил рамки от старого прополиса и пересадил семьи в очищенные выскобленные ульи. Во второй половине июня два раза в одно и то же время взял пробы прополиса и собрал с берез ближайшей полосы по нескольку граммов пазушных почек. Потребовалась немалая работа, но мои помощники решили провести исчерпывающий химический анализ всех компонентов той и другой смеси. К этому времени мы уже выделили из почек березы более 24 соединений и разработали очень эффективные методы анализа, основанные на использовании масс-спектрометрии, которые позволяли идентифицировать все соединения на самом небольшом количестве исходного материала.
Проведя тщательный химический анализ обоих экстрактов, мы получили в результате исчерпывающие характеристики всех основных групп соединений. Сравнение было проведено по 21 соединению — 15 флавоноидным агликонам и 6 кислотам.
Идентичность была полная. Она подтверждалась тщательным масс-спектрометрическим анализом по всем группам выделенных соединений.
Важным было и то, что совпадение распространилось не только на главные, но и на второстепенные (или минорные) компоненты исследуемых фракций. Точно такие же картины наблюдались и для всех остальных групп соединений.
Итак, «ключ плотно вошел в замок», выезд на рязанские просторы оправдал себя, мучительные сомнения остались позади, доказано главное: пчелы используют выделения пазушных почек березы для сбора и приготовления пчелиного клея.
